大连秦楠：中国微生物组计划，5年，5-10亿，

秦楠：中国微生物组计划，5年，5-10亿，这可以有！

1月5日，热心肠先生在清华搞了一次微生物组研究的青年沙龙，随后在参会人的基础上，在微信上搞了两个群，现在已经有600多人了。

插播广告：有意进群的人可以添加热心肠先生的个人微信号：

请务必说明你的单位和职务，我通过好友请求后会拉你进群。

话说这600多人里，藏龙卧虎，做基础研究的大牛一把，临床实践的大牛一把，做微生态产品的产业大牛也一把。

于是，我约这些大牛们每周六晚上给群友们答疑，分享基础研究、临床和应用的相关知识。刚刚过去的周六，我请到了浙江大学医学院的研究员秦楠博士，让他分享自己在相关领域研究的方法和心得。

秦楠博士非常认真，一口气回答了十几个问题，经秦博士同意，今天热心肠先生把它们分享出来。

首先，特别介绍一下秦楠博士：

秦楠，2008年从美国弗吉尼亚理工大学博士毕业（专业微生物学），后加入华大基因负责微生物基因组部门。2011年加入浙江大学传染病诊治国家重点实验室。

目前主要担任感染性疾病协同创新中心研究员，基因组学平台负责人，国际人类微生物组协会（International Human Microbiome Consortium）秘书长，中华预防医学会微生态分会常务委员、中国预防医学会微生态分会青年委员会副主任，消化与营养组副组长。

肝硬化肠道菌群宏基因组研究于2014年发表于《Nature》，2015年《Nature》再次撰文答同行质疑。此外禽流感H7N9患者肠道菌群宏基因组研究2015年发表于Nature子刊《Scientific Reports》上。目前负责973计划《肠道细菌微生态与感染和代谢的研究》课题一《肠道微生态失衡与肝病发生发展的机制研究》。

下面是秦楠博士对问题的解答：

提问者一：黄倜，北京中医药大学博士

问题1：临床上肠道菌的样本采集如何操作和指控，和在动物模型有何区别？

临床上肠道菌群的研究一般以粪便为样品，因为粪便取样无创，粪便菌群能反应部分肠道菌群信息。样本采集一般取后面出来的粪便，而且取粪便中间样本,因为粪便表层含有肠粘膜脱落细胞；而动物模型有的取粪便,有些通过解剖动物来取得肠道菌群样本 ，优点是可以研究肠道不同部位的菌群。

问题2：对菌群结果分析是基于什么标准和原则，某些显著变化菌株一个个分析还是按现在比较流行的“肠型”分析？

现在菌群结果分析主要通过宏基因组测序，从而对样本中的所有菌株进行整体菌群结构和功能分析，其中菌群结构通过与NCBI上细菌基因组数据库比对。

肠型是欧盟MetaHIT组织的Peer Bork及Dusko Ehrlich教授领导的研究团队通过研究4个不同国家人群的肠道微生物，比较他们的饮食习惯、遗传背景、种族、性别、年龄、体重系数等，研究者将人类的肠道类型分为3类：拟杆菌型、普氏菌型和瘤胃球菌型。

拟杆菌属已知擅长于分解碳水化合物，所以这种肠型的人相对不易发胖；普氏菌属擅长于分解肠道黏液，这种黏液会增加肠道疼痛；而某些瘤胃球菌属有助于细胞吸收糖分，使体重增加。研究发现，肠型和遗传背景、种族、性别、年龄、体重系数无关，而与长期的饮食习惯相关。

但是最近肠型的概念受到很多挑战，有些美国学者提出了不同了理念。具体可以参考这篇文章：

Rethinking "enterotypes".

Knights D, Ward TL,McKinlay CE, Miller H, Gonzalez A, McDonald D, Knight R.

Cell Host Microbe. 2014 Oct 8;16(4):433-7. doi: 10.1016/j.chom.2014.09.013.

问题3：有没有现在研究的比较明确的菌株(功能，作用)？例如akkmansia这个菌株很多研究都说他和肠屏障关系密切，具体的机制是什么？再如梭酸菌中是否有有益和有害不同的区分，标准用的什么，厚壁菌等丰度占优势的菌同上。

现在很多研究都是菌群的16S或宏基因组和疾病的关联分析，只能看出哪些细菌和疾病有关联，发现的具体的细菌影响疾病的机制目前还不是完全清楚，目前有一些关于Akk细菌的机制研究，这个细菌在很多研究中被认为和肥胖、糖尿病以及炎症相关。

Amandine Everard, 等人2013年在 PNAS 上的一篇研究把活的A. muciniphila作为疗法可以改善小鼠的代谢情况和粘液层厚度，而热灭活的A. muciniphila不会。这些结果表明A. muciniphila可能在消化道屏障功能、代谢炎症和脂肪储存方面起到了一个关键的作用。

分类来说有梭菌纲、梭菌目、梭菌科、梭菌属。梭菌属的细菌有些可以分泌毒素产生梭菌病，有些活菌制剂对人体有益。产酸的梭菌被称为某酸梭菌。其中丁酸梭菌又称酪酸梭菌在一些文献中被发现在健康人群中富集，其活菌胶囊对感染性急性腹泻和慢性腹泻有较好的疗效。

厚壁菌门是很大一类细菌，多数为革兰氏阳性。厚壁菌门被分为三个纲：厌氧的梭菌纲、兼性或者专性好氧的芽孢杆菌纲，和没有细胞壁的柔膜菌纲。研究表明肠内厚壁菌门多于拟杆菌门导致更有效吸收食物中的热量从而导致肥胖。芽孢杆菌纲中的葡萄球菌属中一些可导致疾病，如葡萄球菌是最常见的化脓性球菌，是医院交叉感染的重要来源；而乳杆菌属中的一些菌常用于益生菌生产发酵乳制品。

门是很大一个范畴，包含成百上千种细菌，不能简单地划分为有益菌有害菌，有些可能是条件致病菌。

提问者二：郑帅，北京安贞医院

问题1：我想向秦楠老师请教一下，宏基因组的信息中，细菌种属与功能基因是如何对应起来的呢？比如同一种基因会存在于多种细菌，那么如何区分不同细菌对于该基因的贡献比例？

宏基因组（Metagenomics）的概念是把肠道菌群作为一个整体来研究，目前宏基因组分析种属和功能基因是分开来分析的，种属基于物种丰度表，功能分析基于基因丰度表。

物种丰度表是将每个样品的测序数据比对到现有公开的物种数据库如NCBI、HMP的微生物数据库中得到的，基因丰度表是将每个样品的测序数据比对到肠道菌群基因集上得到的。肠道菌群基因集一般都是将自己每个样品测序数据进行组装注释出基因，然后和现有公开的基因集合在一起得到的。

不同细菌对某一基因的贡献比例这个问题，据我所知目前还没有研究细到这个地步，2013年德国的Peer Bork团队曾经研究肠道菌群的基因变异问题，感兴趣的可以参考：

Nature. 2013 Jan 3;493(7430):45-50. doi:

10.1038/nature11711. Epub 2012 Dec 5.

Genomic variation landscape of the human gut microbiome.

问题2：有没有哪个数据库，是公开提供健康人群的菌群宏基因信息的？我在医院这边进行宏基因组采样分析，总会遇到这个问题，就是难以获得较好的健康对照。假如有这样一个数据库，便于进行队列分析，就好了。我搜索过MetaHIT和华大的数据库，似乎提供的都是细菌的信息，没有按照受试者个体来提供测序数据。

现在还没有一个独立公开的健康人群菌群宏基因组数据，几乎每篇发表的有影响力的文章都有自己的健康人数据库。 我们2014年在Nature发表的文章里健康人和病人是在同一家医院健康体检中心取得，年龄和病人的基本一致。目前对健康人还没有明确的定义，饮食、地域和年龄对菌群都有一定影响。

我们建议是在疾病研究取样所在医院，至少是同一所城市进行健康样品取样工作。文章发表后数据就公开了，MetaHIT和华大所发表文章的健康人原始测序数据应该是在网上公开的。

提问者三：黄海鹰，TUM在读博士

问题1：高通量测序给了我们海量的数据，过去的10年应该是高通量的一个比较黄金的时代，肠道微生物在过去几年是前所未有的发烧，想知道肠道微生物下一个阶段的发展方向是什么？

过去几年，国际学术界发现了肠道菌群和众多疾病密切相关。从消化道疾病（如肠炎），到代谢类疾病（如II型糖尿病），到传染性疾病（如肝硬化），还有免疫性疾病（如风湿性关节炎）和心脑血管疾病（如动脉粥样硬化）密切相关，可以说，肠道菌群研究给诸多疾病研究提供一个非常好的研究切入。

下一阶段肠道菌群研究必然会深入到疾病发生发展的机制研究过程中，应该在微生物干预治疗方面中会有重大突破，如上海交大赵立平教授在肠道菌群干预和治疗肥胖方面有显著成果。

问题2：现在高通量获得了数据，从菌群结构和基因组方面会有差异，后面是不是应该回归到生物实验，去逐个验证？还有写文章有种无从下手的感觉。

在找到差异后，如何将这些差异结果和具体疾病联系起来，阐述里面可能的机理，是需要大家进一步深入的。有些确实需要加一些生物实验如动物实验进一步验证，获得多方面的证实。

对于写文章的话，推荐一本书《Science Research Writing》by Hilary Glasman-Deal (Imperial College London, UK)。

宏基因组文章最大的特点是你要从大量数据中发现亮点，归纳亮点。首先你需要关注特定物种对疾病的影响；其次你需要关注特定功能基因与疾病的关系，进而关注菌群各代谢机制对疾病的影响，归纳疾病形成可能机制。研究过程你也可能发现疾病相关的菌群标记物或基因标记物，可用于疾病诊断或开发微生态制剂用于治疗，这些都是文章的亮点。

目前国内大部分研究还是单纯的测序以及信息分析为主，这方面我们要向美国同行学习，如吴萌博士在Jeff Gordon实验室的研究成果。现在微生物组学研究越来越把测序当成研究科学问题的一种工具和手段，加上动物实验验证或分子实验验证，这些验证对了解肠道菌群和疾病发生的机理更有帮助。

提问者四：热心肠先生

问题1：可否对靶向肠道菌群治疗肝病做一些介绍和展望？

我们2014年发表的文章发现了肝硬化微生物biomarker,可作为潜在诊断靶点及微生态制剂。2015年关于我们生物标记物的有效性和美国同行进行了一次深入的讨论，进一步的研究目前我们正在实验室开展，相信今后肠道菌群会在肝硬化的诊断及治疗中发挥重大作用。

问题2：我们是否应该推动发起一项中国微生物研究计划？

这是个很好的提议。现在中国的专家学者已经在各个层级呼吁国家发起一项中国微生物组研究计划，据我所知，目前已有不少专家在国际上和在自然基金委，科技部等单位呼吁成立相关计划。我们国家目前对微生物组领域的资助和欧盟美国相比还是差距很大的，他们都是上亿美元级别的资助。

我们国家科技部的973计划的资助在3000到4000万之间，国家自然基金委的重点项目在300万左右，在2013年资助了微生态领域近10个重点项目，但是我国的资助离美国欧盟上亿美元的资助还是有很大差距的。

提问者五：刘冠楠，博奥生物研发

问题1：我们粪便采集的标准是什么，采样应该分点采集，还是分段采集？（因为有报道显示粪便中菌群显示有空间位置性。比如尿液采集中段，那粪便呢？）

现在主要采集后边出来的粪便，比较接近肠内环境。采样取粪便中间，外层会与肠粘膜进行接触，有人类脱落细胞污染。

问题2：还有采集时间呢，早上还是下午采集呢？（当然每人时间可能不同，但是如果规范化的话最好什么时间）

采样时间据我所知，国际上没有固定标准。

提问者六：李卫芬，浙江大学

问题：肝组织中的微生物DNA如何提取？想用荧光定量PCR测定细菌移位。

我们的研究主要研究粪便中的微生物，肝组织中的微生物提取目前我们实验室还没有涉及。这块主要混有大量人源DNA污染，但相信只要PCR引物合适，做荧光定量PCR应该是可以的。

提问者七：郑智俊，南开大学

秦教授，我表姐的孩子刚满8个月，最近出现一些皮疹，去了几次医院都还没好。我知道幼儿的微生态也是很重要的，对于这块及其发展您有什么看法或建议？

造成皮疹的原因有很多，过敏性皮疹是其中一种，具体问题需要具体分析、咨询相关医生，预防与诊治并重。目前对于皮疹、哮喘等过敏性疾病，今年来国际上有“卫生假说”。微生物在幼儿免疫系统形成里起了很重要的作用，目前这块也是我们学术界非常重要的研究前沿，值得大家关注。

其实热心肠先生的微信文章中就有关于“卫生假说”和育儿经验相关的很好的文章。《79个超强微生物知识，全力助你孕育99分超优宝宝》，建议你可以看一看。

提问者八：胡忆虹，科技部生物中心

问题：如果中国微生物组计划研究列入国家重点研发任务，您认为需要多大的支持力度（按照5年测算）？应该开展那些方面的工作？我国的优势在哪？与国际上的差距在哪？哪些研究和技术处于领跑、并跑和跟跑阶段？

5年应该要5-10个亿左右的经费资助吧，现在精准医学都有30多亿的资助。我们还是要做一些基础的研究，像第一期HMP计划那样，系统的把中国各个人群的各个部位进行研究。然后聚焦几种中国人多发的疾病上，像HMP2集中在早期糖尿病，妇科疾病，IBD。

和国际的差距很是挺大的，起码测序仪我们就很差，Illumina今年在JP摩根健康保健会议上又推出了小型化机器，我们主要看华大的测序仪的表现吧。

在肥胖和肝病我们国家目前的研究还是领先的。我们国家还有人口多，相对比较封闭的特点，这对研究遗传和微生物组还是有益的。

提问者九：侯强川，内蒙古农业大学博士

问题：秦楠博士您好，我想问一下现在三代下机的细菌16S全长序列，fastq格式，有没有比较标准的序列质控条件（有文献支持最好），我们现在在处理的时候主要靠pacbio自带的一些工具来实现质控。或者1500bp左右的测序序列要满足怎样的质量条件我们才能保留下来用于后面的分析？

Pacbio的质控比较特殊，由于单碱基有13%的随机错误这个错误没办法用质量分数来判定，16S是通过循环模式对单reads进行重复测序来修正的，通常需要读长大于3倍，进行质控的时候我们也是使用pacbio官方的流程进行的处理。据我了解大家现在都是用官方流程。

追问：谢谢您，我们现在的条件是每条reads不能少于5个pass，就怕质控条件不合适，后面的分析不能反映样品真实的微生物构成就不好了！

是的，这个问题不仅测序有，样本的DNA提取也同样存在，不同的提取方法也会导致有不同的微生物构成。我们发表文章就被reviewer多次问道这个问题。测序方面元码基因的田博士是专家，回答有不准确的，田总来补充啊。

提问者十：王俊忠，华中科技大学讲师

问题：非常感谢秦老师，秦老师是肝病学界研究微生态的专家，我没赶上提问，不过还是想提个问题。婴幼儿感染乙肝病毒后，形成免疫耐受并导致乙肝病毒感染慢性化。目前的主流观点是婴幼儿免疫功能不成熟。另一方面，婴幼儿微生态在免疫成熟中起着非常重要的作用。您能谈谈，婴幼儿微生态与婴幼儿乙肝感染慢性化之间的见解吗？

那个老师的婴幼儿微生态与婴幼儿乙肝感染慢性化之间关系问题，现在我们还没有开展这方面的研究，成人我们是做过的，也只是在meta-GWAS关联研究，关于机理目前还不清楚。

提问者十一：王秋雁，广西医科大学

问题：秦博士您好，目前肠道菌群的研究在动物模型上取得了很大成功，有很多高水平文章发表，但人体肠道菌群方面，好paper不多，是不是因为目前拿来测序的样本不能很好代表真正跟疾病相关的肠道的定植菌落？这些重要的肠粘膜的定植细菌，在粪便中含量可能很低，如果测序深度不够，不容易被发现，对于肠道菌群宏基因组测序，请问您们一般每个样本测几个G的数据量？很多公司一般是测4-5G，但有人说要测12G才能把丰度低于1%的物种测出来。

我们现在研究粪便菌群，并用它代表了肠道菌群，主要是因为取样无创，方便，为今后的诊断打好基础。研究肠粘膜的定值细菌，要用肠镜取样，现在也有人在做。关于测序深度，我们做metaGWAS，一般4G就够了，大家可以参考我们实验室2014年发表的nature文章，和华大2012年糖尿病文章。至于12G才能把丰度小于1%的找出来，目前我还没有看到相关的数据证明。对组装肯定是有帮助的。

问题补充：谢谢秦博士！12G的说法，是前年年底华大在广州搞的宏基因组研讨会，他们技术部展示的数据

对，这个取决于用的测序平台，我们现在一般都是采用illumina的2X150bp测序，性价比比较好。华大今后是否用他们自己生产的基于CG的测序仪器测宏基因组，我们还不知道。期望他们能把测序的价格压下来。现在Illumina有点贵的。

秦楠博士总结

很高兴在热心肠先生这个平台和大家交流。也祝大家在2016年事事顺心，大发paper！

另外通知大家一下：第六届国际人体微生物组大会（International Human Microbiome Consortium）学术会议2016年11月9-11日将在美国休斯顿举行，期待全球学者共同努力，在人类微生物组与健康和疾病研究中取得更大突破。欢迎大家参加！

大家感觉秦楠博士的答问怎么样？你意犹未尽之时，我要预告一下本周热心肠先生邀请到的这位大牛：

田埂博士，毕业于中国科学院研究生院，元码基因创始人。

研究方向为基因组学与合成生物学，曾任清华大学基因组与合成生物学中心主任，华大基因大项目负责人，华北片区负责人，深圳华大基因研究院研发副主管等职务。863重大项目“人工合成酵母基因组”课题组组长。

带领研究团队先后完成项目包括：

国际千人基因组计划；国际大熊猫基因组计划（第一个完全用短测序序列组装的大型动物基因组，文章于2009年12月在《自然》杂志发表）；炎黄一号甲基化研究项目（第一个人类外周血单核细胞全甲基化图谱文章在《Plos Biology》发表）；中丹合作人类代谢系统复杂疾病研究项目（文章在《自然.遗传学》杂志发表）；北京空气污染可吸入微生物研究(环境学权威杂志《环境科学与技术》；人工合成酵母基因组等。以通讯作者和第一作者发表文章20余篇，发明专利8项。

如果你有问题要问田埂博士，请在下面留言，热心肠先生会转发给他并在下周公布他的解答的。