大连热心肠先生: 不懂这10个E，不是专业搞微
热心肠先生: 不懂这10个E，不是专业搞微生物组的！
一夜之间，美国国家微生物组计划公布的消息，如平地一声雷，让羡慕嫉妒恨的中国科研和产业界人士再次被震撼；
点击阅读：《热心肠先生：3个关键词，读懂美国国家微生物组计划》
一夜之间，有些人甚至焦虑了，他们发现：微生物组研究已经一日千里，过去几年的突飞猛进，加上未来几年可能有的逆天突破，恐怕会彻底改变我们对这个世界的认识，而自己似乎进入得太晚了；
一夜之间，专业人士和普通大众，似乎都对微生物与疾病、健康的关系有了新的认识，似乎更明确了肠道微生物的核心作用。
确实，因为有了基因测序为代表的伟大工具，人类在认知自我和世界的路上，已经加足油门，这一夜之间，新的篇章又开启了。
而如果“一两年”也是很短暂的“一夜”，除了震撼人心的研究进展，我们还会发现：
一夜之间，很多科学背景不够的“科学家”可以花钱测序，在世界顶级学术期刊上发表“研究”论文；
一夜之间，热心肠先生这样的科普作者出现了，写几篇流传略广的科普文章，俨然成了“砖家”；
一夜之间，测序公司沸腾了，益生菌、益生元公司沸腾了，彷佛每一个研究进展、每一篇重磅论文，都是产品的背书，更是产品的卖点。
这“一夜之间”，确实任性地发生了很多让人兴奋而又诡异的事！
不严谨的实验、错误的数据、太随意的结论充斥在科学论文里；浮躁、商业化、铜臭味充斥在研究队伍里；不靠谱、伪科学、反科学充斥在产品形态里…
你会觉得意外么？
可惜，这是事实！
怎么办？
正好我前几天看到了一篇奇文《Suddenly everyone is a microbiota specialist! 突然之间，人人都成了菌群专家！》，核心内容是：
① 介绍10个“E”打头的英文关键词；② 说明如何通过改进实验和数据分析方法，以增加可信度；③ 呼吁数据产生后，要更为严谨下结论；④ 提醒人们看到相关研究要注意分辨利益相关性。
很显然，这是正本清源的好文章！
今天我试着把其中一些内容翻译成中文，配上图，夹带一点我的私货，分享出来，希望对你有帮助：
Extraction提取
话说我写这篇文章，还挺诚惶诚恐的，毕竟这是一篇专业性很强的科普，而自己上一次提取DNA，是在十几年前了。
大概过程我还是记得的：十几年前，在教学实验上，我们还需要自己配制试剂来提取DNA；在研究实验室会好很多，已经有了很好用的试剂盒，照流程一步步走，几次离心后就可以获得DNA。
十几年后的今天，看到奇文第一个E提醒大家要注意提取方法，还是蛮亲切的，也很认同：
不同的提取方法，会严重影响微生物组分析的最终结果；使用不同的DNA提取试剂盒，对同一个样本进行分析，会得到不同的微生物组成结果。
看到这个，你会不会心里一紧，会突然想要认真选择自己要用的试剂盒？
从一开始，就请慎之又慎，选择公认的靠谱的试剂盒！
E②
Environment环境
没有Control（对照），就没有发言权！
微生物无处不在、无孔不入，空气、PCR仪、移液枪、Eppendorf管、试剂甚至常用的试剂盒里，都有它们的存在。
在做实验的时候，一定别忘了把它们的DNA也提出来去测序，做数据分析的时候，一定别忘了“减去”它们。否则你做鼻腔擦拭样本、血液等含微生物本来就不多，甚至常规状态下基本无菌的样本，可能会得到南辕北辙的结果。
各大杂志的编辑们，看到不扣除阴性对照的微生物组论文投稿，建议咔擦一下，直接拒掉！
E③
Efficiency效率
看到上面这张PCR图，是不是感觉很熟悉、很亲切？但我要告诉你严酷的事实：
用标准PCR方法时，不同16S rRNA基因序列的扩增效率可能不一样，也就是说，有些序列扩增会快一些，有些会慢一些。
经过N个循环的扩增，因为效率不一，微生物的量会“人为”地发生变化，无法准确反映样本的实际状态。
而使用Micelle PCR，则可能有效避免这个问题。这个你最好照做，哪天如果因为我这一句提醒，你中稿了，别忘了发个红包给我。
呃(⊙o⊙)…
E④
Exaggeration夸大
如果哪天你在做16S rRNA基因序列分析时，突然很兴奋，感觉自己似乎“发现”了N个新物种！
你可不要高兴太早，要且慢且慢冷静一下，因为很有可能你分析的是嵌合序列。
什么是嵌合序列？看看上面这张图，你大概会懂吧？你看到的“新序列”，有可能是“老序列”被打断后重新拼接时组成的“混合序列”。
当软件告诉你它识别不出一段序列的时候，你务必排除嵌合序列的可能性，排除了之后，还依然判断是新序列，那可能要恭喜你发现了新物种！
也提醒你一句：避免嵌合序列的一种方法，仍然是使用Micelle PCR做基因扩增；而避免数据分析和组装时出现嵌合，使用一次能测超长序列的三代测序，也是可以适当考虑的。
呃(⊙o⊙)…不知道我是不是可以去“伪装”一下微生物分析专家了？
其实，我什么都不懂。
E⑤
Evaluation评估
用不同的聚集算法评估测序数据，可能会得到不同的结果；而精确的16S rRNA分类，要依靠SILVA、RDP、GreenGenes和NCBI等参考数据库，这些数据库本身含有很多未经确认或不完整的序列，这些“不完美”甚至“有些糟糕”的数据库，有时会毁掉“可能很完美”的数据。
所以，在评估你的微生物样本的时候，小心求证，别迷信软件和数据库，才能得到真正精准的结果。
呃(⊙o⊙)…
做个微生物组研究真的好心累啊！看来写科普还是比做实验容易不少！
E⑥
Elongation延伸
一般来说，研究者只会对16S rRNA基因进行一小段测序，在用来做微生物分类的时候，这基本不足以用来鉴定到“种”的水平。
有一些属，比如我特别喜欢的Akk菌所在的属，种与种之间的16S序列差别很大，用16S测序来鉴定种，问题不大；但很多其他属可不是这样，种与种之间16S序列差异很小，你就可能出错。
所以你要记得，用16S序列做分类，做到属水平的，靠谱，做到种水平的，可能很不靠谱！
想做到株？呃(⊙o⊙)…
16S貌似做不到！
E⑦
Equality平等
拷贝数啊拷贝数，据说很多人会在这个问题上栽跟头。
结核杆菌的基因组有1个16S rRNA基因拷贝，但拜氏梭菌却有14个！所以如果你只是做了常规16S序列分析，用16S rRNA的基因数量来说明微生物数量和相对丰度，那可能会大错特错。
小心啊！
很多研究用16S分析出来的微生物数据，很有可能是不靠谱的，很多数据应该只是“16S rRNA基因拷贝数”的结果，而不是微生物数量的结果。
失之毫厘谬以千里！呃(⊙o⊙)…
很多群众要说，我们不明真相多年啊，怎样才可以雾里看到花？据说结合定量或数字PCR可以解决一些问题，这个值得你去尝试。
E⑧
Evidence证据
现在，很多微生物组的分析，主要通过生物信息方法和推测，来说明某些微生物的重要临床作用，可研究者往往忽略“科赫法则”或者新的分子诊断标准和方法。
只是分析OUT和疾病的关系，而不是先找到对应生命体，然后用科赫法则确定关系，是不严谨的。
你可能会说很多细菌根本培养不了，怎么做科赫法则分析？
其实，现在越来越多原来认为不能培养的微生物可以被培养了，不信你看《自然》杂志最近的文章：
所以，不要把不能分离培养作为理由，来掩盖你的不严谨或者水平不够。
还有要注意的：只是做DNA测序和分析，你区别不了微生物是活的还是死的。
这在你分析采用抗生素或其他抑菌方法处理过的样本时，尤其可能得到错误结果：样本里的微生物可能已经“死亡”很长时间了，你测到了它们的尸体，却可能误以为它们还活着在兴风作浪。
怎样，收集证据支持研究这条路不好走吧？
在这里，也特别推荐上海交大赵立平教授关于“菌株水平分析”的综述，希望对正在寻找“证据”的你有帮助：
也插播一个广告：
我们现在有几个专门讨论微生物组研究和应用的500人大群，有意入群并跟赵立平老师等近3000位专业人士探讨的人，请加我的个人微信号：
加我时请注明单位和职务，我会邀请你进群。
我们继续：
E⑨
Enrolment造册
很多微生物研究，采用的样本量不够或者取样只能代表局部的情况，这可能是不严谨的。
做环境微生物研究时，多点取样、集合造册统计、综合性分析，才能真正看到生态系统中微生物的分布和角色。
那问题来了：做肠道微生物研究时，粪便样本只代表肠道最末端的情况，仅仅采集粪便做研究，足够代表整个肠道微生态么？
恐怕是不太够，但因为取样方法所限，目前还主要只能这样了，但如果有谁突破实验方法，会有大Paper发的。
呃(⊙o⊙)…是不是感觉越来越难混日子了？
科学本就需要严谨，做微生物研究，从今往后千万别再简单粗暴了，张飞也要学会绣花哦。
E⑩
Expectations预期
上面两句话，经常读文献的你很熟悉吧？
“靠谱”的杂志都要请作者说明利益相关问题，绝大多数人都“老实”地说自己的研究没有接受商业经费支持、没有利益相关。
你信么？呵呵
这个问题，在中国尤其值得问一问，有多少教授可以非常坦然地说，自己的研究背后没有商业考究？
不知道大家有没有遇到过：学术会议上，外场摆台做宣传的公司和人要花钱，内场本应专心做学术演讲但严重植入广告的人却还能收钱。
有没有感觉怪怪的？呵呵。
在阅读微生物组研究论文的时候，请多留一点心：很多论文是一些“科学家”从测序公司买的；很多研究是完全夹杂私货、完全是有商业企图的；很多临床实验是益生菌、益生元企业主导的，公布的数据是有偏向性的…
风干物燥，小心火烛！哦，不对，小心“‘做出来’的研究”！
呃(⊙o⊙)…引号很高能，我是不是又真相了？
今天的文章就是这样了，作为主要参考的《Clinical Microbiology and Infection》上的奇文，你可以到MC系统下载到：
希望奇文和我都能帮到你，我们一起愉快地“伪装”自己是“砖家”吧~
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